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Material und Methoden

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Reagenz C ddCTP, Tris HCl pH 9,5,

Magnesiumchlorid, Tween™ 20,

Nonidet™ P-40, 2-Mekaptoethanol,

dATP, dCTP, dTTP, 7-deaza-dGTP,

thermostabile Pyrophosphatase,

Thermo Sequenase DNA Polymerase

Reagenz G ddGTP, Tris HCl pH 9,5,

Magnesiumchlorid, Tween™ 20,

Nonidet™ P-40, 2-Mekaptoethanol,

dATP, dCTP, dTTP, 7-deaza-dGTP,

thermostabile Pyrophosphatase,

Thermo Sequenase DNA Polymerase

Reagenz T ddTTP, Tris HCl pH 9,5,

Magnesiumchlorid, Tween™ 20,

Nonidet™ P-40, 2-Mekaptoethanol,

dATP, dCTP, dTTP, 7-deaza-dGTP,

thermostabile Pyrophosphatase,

Thermo Sequenase DNA Polymerase

Formamid loading dye Formamid, EDTA, Methylviolett

•

Oligonukleotid-Primer (Fa. Pharmacia Biotech, Uppsala/Schweden)

•

DEPC-H

•

TBE-Puffer 0,6x

2.7.3 Durchführung

In der vorliegenden Arbeit wurden all die Patientenproben sequenziert, die in

der vorangegangenen SSCP-Analyse durch abberante Bandenmuster auffielen.

Die Sequenzierung besteht aus drei Arbeitsschritten: 1. PCR mit Sequenz-

Primern, 2. DNA-Aufarbeitung und Cycle-Reaktion und 3. Sequenzierung.

Am Anfang steht die PCR mit den in Abschnitt 2.7.1 beschriebenen

modifizierten Sequenz-Primern. Dabei wird die doppelte Menge an DNA

verwendet, um genügend Material für die Sequenzierung zu gewinnen. Da die

optimalen Bedingungen je nach Primer unterschiedlich sind, sind diese vorher

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